Вивчення механізмів деградації фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris
Анотація
Мета. Дослідити шляхи деградації фруктозо-1,6-бісфосфатази у метилотрофних дріжджів Pichia pastoris. Методи. Використовувалися методи визначення питомої активності фруктозо-1,6-бісфосфатази у дикого і мутантних штамах метилотрофних дріжджів P. pastoris за перенесення клітин із середовища з метанолом на середовище з глюкозою. Дослідження вмісту білка фруктозо-1,6-бісфосфатази проводили за допомогою Вестерн-блот аналізу. Результати. Досліджено зміни в активності фруктозо-1,6-бісфосфатази у контрольного штаму дикого типу GS200, штаму з делецією гена сенсора гексоз GSS1 та штаму з дефектом автофагії SMD1163 P. pastoris за короткотривалої та довготривалої індукції метанолом із додаванням або ж без додавання інгібітора протеосомної деградації MG132. Досліджено деградацію фруктозо-1,6-бісфосфатази методом Вестерн-блот аналізу у штамах GS200, SMD1163 та Δgss1. Висновки. Показано, що тривалість інкубації клітин на метанолі не має особливого впливу на інактивацію ферменту. Ефект протеосомного інгібітора MG132 був незначний. Катаболітна інактивація цитозольних і пероксисомних ферментів пошкоджена в ∆gss1 мутанта, оскільки пошкоджене сигналювання глюкозою. Фруктозо-1,6-бісфосфатаза деградує вакуолярним шляхом, незалежно від тривалості індукції метанолом, що корелює з даними з активності цього ферменту.
Ключові слова: фруктозо-1,6-бісфосфатаза, дріжджі, Pichia pastoris, метанол, автофагія.
Посилання
Gellissen G. Hansenula polymorpha: Biology and Applications. Edited by G. Gellissen. 2002. WILEY.
Krasovska O.S., Stasyk O.G., Nahorny V.O., Stasyk O.V., Granovski N., Kordium V.A., Vozianov O.F., Sibirny A.A. Glucose-induced production of recombinant proteins in Hansenula polymorpha mutants deficient in catabolite repression. 2007. Biotechnol. Bioeng. Vol. 97. P. 858–870. doi: 10.1002/bit.21284.
Grabek-Lejko D., Sibirny V., Sibirny A. Regulation of gene expression in methylotrophic yeasts. Postepy biochemii. 2013. Vol. 59. P. 95–106.
Farré J., Vidal C., Subramani S. A cytoplasm to vacuole targeting pathway in P. pastoris. Autophagy. 2007. Vol. 3. P. 230–234. doi: 10.4161/auto.3905.
Farré J.C., Subramani S. Peroxisome turnover by micropexophagy: an autophagy-related process. Trends Cell Biol. 2004. Vol. 14. P. 515–523. doi: 10.1016/j.tcb.2004.07.014.
Kirkin V., McEwan D.G., Novak I., Dikic I. A role for ubiquitin in selective autophagy. Mol. Cell. 2009. Vol. 34. P. 259–269. doi: 10.1016/j.molcel.2009.04.026.
Sibirny A.A. Mechanisms of autophagy and pexophagy in yeasts. Biochemistry (Mosc). 2011. Vol. 76. P. 1279–1290. doi: 10.1134/S0006297911120017.
Sibirny A.A. Yeast peroxisomes: structure, functions and biotechnological opportunities. FEMS Yeast Research. 2016. Vol. 16, N. 4. doi: 10.1093/femsyr/fow038.
Naujokat C., Hoffman S. Role and function of the 26S proteasome in proliferation and apoptosis. Lab. Invest. 2002. Vol. 82. P. 965–980.
Hung G.C., Brown C.R., Wolfe A.B., Liuand J., Chiang H.L. Degradation of the gluconeogenic enzymes fructose-1,6-bisphosphatase and malate dehydrogenase is mediated by distinct proteolytic pathways and signaling events. J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 49138–49150. doi: 10.1074/jbc.M404544200.
Brown C.R., Wolfe A.B., Chiang H.L. The vacuolar import and degradation pathway merges with the endocytic pathway to deliver fructose-1,6-bisphosphatase to the vacuole for degradation. J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283. P. 26116–26127. doi: 10.1074/jbc.M709922200.
Menssen R., Schweiggert J., Schreiner J., Kusevic D., Reuther J., Braun B., Wolf D.H. Exploring the topology of the Gid complex, the E3 ubiquitin ligase involved in catabolite-induced degradation of gluconeogenic enzymes. J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287. P. 25602–25614. doi: 10.1074/jbc.M112.363762.
Giardina B.J., Chiang H.L. Fructose-1,6-bisphosphatase, malate dehydrogenase, isocitrate lyase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and cyclophilin A are secreted in Saccharomyces cerevisiae grown in low glucose. Commun. Integr. Biol. 2013. Vol. 6. P. 27216. doi: 10.4161/cib.27216.
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randal R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265–275.
Baerends R.J., Faber K.N., Kram A.M., Kiel J.A., van der Klei I.J., Veenhuis M. A stretch of positively charged amino acids at the N terminus of Hansenula polymorpha Pex3p is involved in incorporation of the protein into the peroxisomal membrane. J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, No. 14. P. 9986–9995. doi: 10.1074/jbc.275.14.9986
Tuttle D.L., Dunn A.J. Divergent modes of autophagy in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Cell. Sci. 1995. Vol. 108. P. 25–35.
