Оптимізація методу ChIP для дослідження регуляції генів-мішеней канонічного ВНТ сигналінгу у новонародженому серці
Анотація
Мета. Метою нашої роботи було оптимізувати метод хроматинімунопреципітації (ChIP) з наступною валідацією із застосуванням ПЛР у реальному часі для аналізу функції b-катеніну та плакоглобіну у регуляції експресії генів-мішеней канонічного ВНТ сигналінгу у новонародженому серці. Методи. Дослідження проводили із використанням тканини новонароджених сердець мишей віком 3 доби після народження (P3). Аналізували як тканину серця контрольних мишей, так і мишей із делецією одного алеля гена β-катеніну. Методику ChIP проводили, ґрунтуючись на стандартних протоколах із власними модифікаціями, викладеними у статті. Валідацію результатів ChIP проводили із застосуванням методу ПЛР у реальному часі. Результати. У результаті проведеної роботи нами було адаптовано метод ChIP для вивчення сигнальної функції β-катеніну та плакоглобіну й аналізу специфічних ділянок геному, з якими зв’язуються досліджувані нами білки у новонародженому міокарді. Висновки. Було показано, що за умови гетерозиготного нокауту гена β‑катеніну плакоглобін здатний компенсувати його сигнальну функцію та зв’язуватись із тими ж фрагментами геному, що й β-катенін.
Ключові слова: β-катенін, плакоглобін, Wnt-сигналінг, експресія генів, міокард, хроматинімунопреципітація, ChIP.
Посилання
Terrence S. Furey. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat. Rev. Genetics. 2012. Vol. 13. P. 840–852. doi: 10.1038/nrg3306.
Edison T.L., Sebastian P., Mikael H.Q. A: ChIP-seq technologies and the study of gene regulation. BMC Biology. 2010, Vol. 8, No. 56. P. 1–6. doi: 10.1186/1741-7007-8-56.
Nakato R., Shirahige K. Recent advances in ChIP-seq analysis: from quality management to whole-genome annotation. Briefings in Bioinformatics. 2016. P. 1–12. doi: 10.1093/bib/bbw023.
Piven O., Winata L.C. The canonical way to make a heart: β-catenin and plakoglobin in heart development and remodeling. Experimental biology and medicine. 2018. Vol. 242, No. 18. P. 1735–1745. P. 1–11. doi: 10.1177/1535370217732737.
Agah R., Frenkel P.A., French B.A., Michael L.H., Overbeek P.A., Schneider M.D. Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo. J. Clin. Invest. 1997. 100. P. 169–179.
Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., Behringer R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2003.
Carey M.F., Peterson C.L., Smale S.T. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). Cold Spring Harbor Protocols. 2009. doi: 10.1101/pdb.prot5279.
Wisniewska M.B., Misztal K., Michowski W. et al. LEF1/β-Catenin Complex Regulates Transcription of the Cav3.1 Calcium Channel Gene (Cacna1g) in Thalamic Neurons of the Adult Brain. The Journal of Neuroscience. 2010. Vol. 30, No. 14. P. 4957–4969. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1425-09.2010
