Отримання рекомбінантного злитого білка Rhil7-Cbd
Анотація
Мета. Метою роботи було отримання рекомбінантного злитого білка на основі інтерлейкіну-7 людини (rhIL7) і целюлозо-зв’язуючого домену (CBD). Методи. У плазмідний вектор pET24a(+) субклоновано ДНК послідовності, які кодують rhIL-7 і CBD. Вектор містив послідовність 6His-tag, що дозволяє проводити хроматографічне очищення цільового білка. Плазмідним вектором pET24-rhIL7-CBD трансформували клітини E. coli штаму BL21(DE3). Синтез білка в отриманих клонах-продуцентах індукували внесенням ІПТГ і за протоколом аутоіндукції. Результати. Сконструйовано експресійну касету pET24-rhIL7-CBD. Отримано клони-продуценти, що дозволяють проводити синтез злитого білка rhIL7-CBD. Встановлено, що, на відміну від індукції ІПТГ, застосування протоколу аутоіндукції забезпечує синтез білка в E. coli. Білок накопичувався у цитоплазматичній фракції білків у формі тілець включення. Відпрацьовано метод хроматографічного очищення rhIL7-CBD із бактерійних тілець включення in vitro. Висновки. Отриманий білок rhIL7-CBD надалі може бути іммобілізований на полісахаридній матриці та застосований для виділення та очищення специфічних до rhIL-7 поліклональних антитіл, а також для якісного і кількісного аналізу рецепторів до IL-7.
Ключові слова: IL-7, CBD, бактерійні тільця включення, ренатурація.
Посилання
Lundström W., Fewke N.M., Mackall C.L. IL-7 in human health and disease. Seminars in immunology. 2012. Vol. 24. P. 218–224. doi: 10.1016/j.smim.2012.02.005.
Gao J., Zhao L., Wan Y.Y., Zhu B. Mechanism of action of IL-7 and its potential applications and limitations in cancer immunotherapy. Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol. 16. P. 10267–10280. doi: 10.3390/ijms160510267.
Lin J., Zhu Z., Xiao H., Wakefield M.R., Ding V.A., Bai Q., Fang Y. The role of IL-7 in Immunity and Cancer. Anticancer Research. 2017. Vol. 37. P. 963–967. doi: 10.21873/anticanres.11405.
Savino A.M., Izraeli S. Interleukin-7 signaling as a therapeutic target in acute lymphoblastic leukemia. Exp. Rev. of Hemat. 2017. Vol. 10. P. 183–185. doi: 10.1080/17474086.2017.1292121.
Mackall C.L., Fry T.J., Gress R.E. Harnessing the biology of IL-7 for therapeutic application. Nat. Rev. Immunol. 2011. Vol. 11. P. 330–342. doi: 10.1038/nri2970.
Slyvka A.V., Okunev O.V. Molecular mechanisms of versatile biological activity of interleukin-7. Biopolym. Cell. 2014. Vol. 30. P. 349–357. doi: 10.7124/bc.0008B1.
Usenko M.O., Okunev O.V., Bentsionova K.I., Gorbatiuk O.B., Irodov D.M., Kordium V.A. Obtaining of the recombinant rhIL7-BAPmut fusion protein and its functional characterization. Factors in Experimental Evolution of Organisms. 2019. Vol. 25. P. 321–326. [in Ukrainian] doi: 10.7124/FEEO.v25.1185
Morag E., Lapidot A., Govorko D., Lamed R., Wilchek M., Bayer E.A., Shoham Y. Expression, purification, and characterization of the cellulose-binding domain of the scaffoldin subunit from the cellulosome of Clostridium thermocellum. Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61, No. 5. P. 1980–1986. doi: 10.1128/AEM.61.5.1980-1986.1995
Gilchuk P.V., Volkov G.L. Immobilization of mouse singlechain antibodies for affinity chromatography using the cellulose-binding protein. Ukr. Biokhim. Zhur. 2006. Vol. 78, No. 4. P. 160–163.
Gilchuk P.V., Okunev O.V., Pavlova M.V., Irodov D.M., Gorbatyuk O.B. Obtaining of ScFv-CBD fusion protein and its application for affinity purification of recombinant human interferon a2b. Ukr. Biochem. J. 2006. Vol. 78, No. 2. P. 52–61. [in Ukrainian]
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory Manual. Second edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1659 p.
Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 41. P. 207–234. doi: 10.1016/j.pep.2005.01.016.
Gorbatiuk O.B., Nikolayev U.S., Irodov D.M., Dubey I.Ya., Gilchuk P.V. Refolding of ScFv-CBD fusion protein from Escherichia coli inclusion bodies. Biopolym. Cell. 2008. Vol. 24, No. 1. Р. 51–59. [in Ukrainian] doi: 10.7124/bc.000790
