Створення генетичного вектору для редагування геному рослин, що несе ген синтезу бактеріального білка CAS9

  • І. С. Гнатюк
  • О. І. Варченко
  • М. Ф. Парій
  • Ю. В. Симоненко
DOI: https://doi.org/10.7124/FEEO.v26.1263

Анотація

Мета. Створення генетичної конструкції для редагування геному рослин, що містить ген синтезу бактеріального білка Cas9, репортерний ген β-глюкуронідази gus, а також маркерний ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази bar. Методи. В роботі використовували молекулярно-біологічні, біотехнологічні, мікробіологічні та біоінформаційні методи; для створення генетичних конструцій – метод молекулярного клонування Golden Gate. Результати. В результаті роботи створено генетичну конструкцію pSPE2053, яка несе ген синтезу ендонуклеази Cas9, гени gus та bar; правильність збірки всіх елементів вектора підтверджено за допомогою полімеразної ланцюгової реакції; конструкцію перенесено в клітини Escherichia coli та Agrobacterium tumefaciens; експресію гена β-глюкуронідази перевірено за допомогою гістохімічного аналізу після транзієнтної генетичної трансформації махорки Nicotiana rustica L. Висновки. Створена генетична конструкція може бути використана для редагування геному рослин як за стабільної, так і за транзієнтної генетичної трансформації для накопичення рекомбінантного білка Cas9. В такі рослини в подальшому можуть бути перенесені послідовності направляючих РНК із використанням або стабільної/транзієнтної генетичноїї трансформації або традиційних методів схрещування.

Ключові слова: клонування, генетична конструкція, гени gus та bar, білок ендонуклеаза Cas9, транзієнтна експресія.

Посилання

Yue J.-J., Hong C.-Y., Wei P., Tsai Y.-C., Lin C.-S. How to start your monocot CRISPR/Cas project: plasmid design, efficiency detection, and offspring analysis. Rice. 2020. Vol. 13. doi: 10.1186/s12284-019-0354-2.

Doudna J.A., Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014. Vol. 346. doi: 10.1126/science.1258096.

Nemudryy A.A., Valetdinova K.R., Medvedev S.P., Zakíyan S.M. Sistemy Redaktirovaniya Genomov TALEN I CRISPR/Cas – Instrumenty Otkrytiy. Acta Naturae. 2014. Vol. 6. P. 20–42. [in Russian]

Engler C., Kandzia R., Marillonnet S. A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability. PLoS One. 2008. Vol. 3. e3647. doi: 10.1371/journal.pone.0003647.

Weber E., Engler C., Gruetzner R., Werner S., Marillonnet S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 2011. Vol. 6 (2). e16765. doi: 10.1371/journal.pone.0016765.

Engler C., Youles M., Gruetzner R., Ehnert T.-M., Werner S., Jones J.D., Patron N.J., Marillonnet S. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 2014. Vol. 3 (11). P. 839–843. doi: 10.1021/sb4001504.

Werner S, Engler C, Weber E, Gruetzner R, Marillonnet S. Fast track assembly of multigene constructs using Golden Gate cloning and the MoClo system. Bioeng Bugs. 2012. Vol. 3 (1). P. 38–43. doi: 10.1371/journal.pone.0016765.

Van Die I., Bergmans H., Hoekstra W. Transformation in Escherichia coli: Studies on the Role of the Heat Shock in Induction of Competence. Microbiology. 1983. Vol. 129. P. 663–670. doi: 10.1099/00221287-129-3-663.

Froger A., Hall J. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. 2007. Vol. 6. e253. doi: 10.3791/253.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 545 p.

Bertani G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 1951. Vol. 62 (3). P. 293–300.

Leuzinger K., Dent M., Hurtado J., Stahnke J., Lai H., Zhou X., Chen Q. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins, JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2013. Vol. 77. e50521. P. 1–9. doi: 10.3791/50521.

Jefferson R. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter. 1987. Vol. 5. P. 387–405.

Quimisse M.G., Kabardaeva K.V., Gra O.A., Tyurin А.А. Contribution of Consensus 5'-Untranslated Region to the Translational Efficiency of Heterologous Genes in Plant Cells. Bulletin of Peoples’ Friendship University of Russia: Series Agronomy and Animal Industries. 2015. Vol. 3. P. 56–68. [in Russian]

Sugio T., Satoh J., Matsuura H., Shinmyo A., Kato K. The 5′-Untranslated Region of the Oryza sativa Alcohol Dehydrogenase Gene Functions as a Translational Enhancer in Monocotyledonous Plant Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2008. Vol. 105. P. 300–302. doi: 10.1263/jbb.105.300.

Liu X., Wu S., Xu J., Sui C., Wei J. Application of CRISPR/Cas9 in plant biology. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2017. Vol. 7. P. 292–302. doi: 10.1016/j.apsb.2017.01.002.

Wei H., Meilan R., Brunner A.M., Skinner J.S., Ma C., Strauss S.H. Transgenic sterility in Populus: expression properties of the poplar PTLF, Agrobacterium NOS and two minimal 35S promoters in vegetative tissues. Tree Physiology. 2006. Vol. 26. P. 401–410. doi: 10.1093/treephys/26.4.401.

Nekrasov V., Staskawicz B., Weigel D., Jones J., Kamoun S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 2013. Vol. 31. P. 691–693. doi: 10.1038/nbt.2655.

Baltes N., Hummel A., Konecna E., Cegan R., Bruns A., Bisaro D., Voytas D. Conferring resistance to geminiviruses with the CRISPR–Cas prokaryotic immune system. Nature Plants. 2015. Vol. 1. 15145. doi: 10.1038/nplants.2015.145.