Вплив білка-супресора посттранскрипційного сайленсингу Р19 на рівень транзієнтної експресії гена gfp в рослинах махорки Nicotiana rustica L.

  • О. І. Варченко
  • М. С. Дзуг
  • М. Ф. Парій
  • Ю. В. Симоненко
DOI: https://doi.org/10.7124/FEEO.v26.1262

Анотація

Мета. Створення генетичних конструкцій для вивчення впливу вірусного білка-супресора посттранскрипційного сайленсингу генів Р19 на транзієнтну експресію та накопичення репортерного зеленого флуоресцентного білка GFP. Методи. Для створення генетичних конструкцій використовували метод молекулярного клонування Golden Gate; листкові тканини рослин махорки Nicotiana rustica L. інфільтрували суспензією Agrobacterium tumefaciens L.; рівень експресії гена gfp визначали задопомогою спектрофлуориметричного та кількісного білкового (метод Бредфорда) аналізів. Результати. В результаті роботи створено генетичну конструкцію pSPV2324, яка містила репортерний ген зеленого флуоресцентного білка gfp та ген синтезу вірусного білка-супресора посттранскрипційного сайсенсингу p19, та визначено їх вплив на накопичення рекомбінантного білка GFP. Порівняльний аналіз рівня експресії гена gfp без та з геном синтезу білка-супресора в генетичному векторі показав, що рівень флуоресценції білка GFP в тканинах махорки за спектрофлуориметричним аналізом був в 1,3 раза вищий за використання конструкції з геном супресора p19. Висновки. Вперше доведено позитивний ефект впливу вірусного супресора сайленсингу генів Р19 на накопичення рекомбінантного білка GFP у рослин махорки N. rustica L. Збільшення рівня флуоресценції білка GFP за використання конструкції з геном білка-супресора p19 за спектрофлуориметричним аналізом збігається зі збільшенням сумарної концентрації загальних водорозчинних білків та рівнем флуоресценції білка GFP за їх нативного електрофоретичного розділення.

Ключові слова: клонування, генетичні конструкції, транзієнтна експресія, білок-супресор сайленсингу P19, зелений флуоресцентний білок (GFP).

Посилання

Kapila J., de Rycke R., van Montagu M., Angenon G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci., 1997, Vol. 122 (1). P. 101–108. doi: 10.1016/S0168-9452(96)04541-4.

Fischer R., Vaquero-Martin C., Sack M., Drossard J., Emans N. Commandeur U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. Vol. 30 (2). P. 113–116. doi: 10.1111/j.1470-8744.1999.tb00900.x.

Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23 (6). P. 718–723. doi: 10.1038/nbt1094.

Gleba Y., Klimyuk V., Marillonnet S. Magnifection – a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 2005. Vol. 23 (17-18). P. 2042–2048. doi: 10.1016/j.vaccine.2005.01.006.

Giddings G., Allison G., Brooks D., Carter A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nat. Biotechnol. 2000, Vol. 18. P. 1151–1155. doi: 10.1038/81132.

Johansen L.K., Carrington J.C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiol. 2001, Vol. 126 (3). P. 930–938. doi: 10.1104/pp.126.3.930.

Malinovskiy V.I., Borovskiy G.B., Gorbyleva E.L., Fedoseeva I.V., Tauson, E.L., Sokolov V.A., Voynikov V.K. Rol'

korotkikh RNK v ustoychivosti rasteniy k bioticheskim i abioticheskim stressam. Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii. 2013, Vol. 17 (1). P. 96–103. [in Russian]

Kirgizova I.V., Ergaliev T.M. Kharakteristika belka-supressora R19 virusa Tomato bushy stunt virus. Scientific Cooperation Center “Interactive plus”. 2017. P. 1–6. [in Russian]

Voinnet O., Rivas S., Mestre P., Baulcombe D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 2003. Vol. 33 (5). P. 949–956. doi: 10.1046/j.1365-313X.2003.01676.x.

Leuzinger K., Dent M., Hurtado J., Stahnke J., Lai H., Zhou X., Chen Q. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2013. Vol. 77. P. e50521. doi: 10.3791/50521.

Shamloul M., Trusa J., Mett V., Yusibov, V. Optimization and utilization of Agrobacterium-mediated transient protein production in Nicotiana. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2014. Vol. 86. P. e51204. doi: 10.3791/51204.

Conley A.J., Zhu H., Le L.C., Jevnikar A.M., Lee B.H., Brandle J.E., Menassa R. Recombinant protein production in a variety of Nicotiana hosts: a comparative analysis, Plant biotechnology journal. 2011. Vol. 9 (4). P. 434–444. doi: 10.1111/j.1467-7652.2010.00563.x.

Engler C., Gruetzner R., Kandzia R., Marillonnet S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PloS one. 2009. Vol. 4 (5). P. 5553. doi: 10.1371/journal.pone.0005553.

Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher, D.C. Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression. Science. 1994. Vol. 263. P. 802–805. doi: 10.1126/science.830329.

Weber E., Engler C., Gruetzner R., Werner S., Marillonnet S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 2011. Vol. 6 (2). P. e16765. doi: 10.1371/journal.pone.0016765.

Engler C., Youles M., Gruetzner R., Ehnert T.-M., Werner S., Jones J.D., Patron N.J., Marillonnet S. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 2014. Vol. 3 (11). P. 839–843. doi: 10.1021/sb4001504.

Werner S, Engler C, Weber E, Gruetzner R, Marillonnet S. Fast track assembly of multigene constructs using Golden Gate cloning and the MoClo system. Bioeng Bugs. 2012. Vol. 3 (1). P. 38-43. doi: 10.1371/journal.pone.0016765.

Froger A., Hall J.E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments: JoVE. 2007. Vol. 6. P. e253. doi: 10.3791/253.

Lerner C.G., Inouye, M. Low copy number plasmids for regulated low-level expression of cloned genes in Escherichia coli with blue/white insert screening capability. Nucleic acids research. 1990. Vol. 18 (15). P. 4631. doi: 10.1093/nar/18.15.4631.

Lezin G., Kosaka Y., Yost H.J., Kuehn, M.R., Brunelli, L. A one-step miniprep for the isolation of plasmid DNA and lambda phage particles. PLoS One. 2011. Vol. 6 (8). P. e23457. doi: 10.1371/journal.pone.0023457.

Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 545 p.

Varchenko O.I., Krasyuk B.M., Fedchunov O.O., Zimina О.V., Parii M.F., Symonenko Yu.V. Genetic constructs creating using Golden Gate method, Factors in experimental evolution of organisms. 2019. Vol. 25. P. 190–196. [in Ukrainian]

Leuzinger K., Dent M., Hurtado J., Stahnke J., Lai H., Zhou X., Chen Q. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins, JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2013. Vol. 77. e50521. P. 1–9. doi: 10.3791/50521.

Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248–254. doi: 10.1006/abio.1976.9999.

Liu L., Zhang Y., Tang S., Zhao Q., Zhang Z., Zhang H., Xie Q.. An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana. The Plant Journal. 2010. Vol. 61 (5). P. 893–903. doi: 10.1111/j.1365-313X.2009.04109.x

Siddiqui S.A., Sarmiento C., Truve E., Lehto H., Lehto K. Phenotypes and functional effects caused by various viral RNA silencing suppressors in transgenic Nicotiana benthamiana and N. tabacum. Molecular plant-microbe interactions. 2008. Vol. 21 (2). P. 178–187. doi: 10.1094/MPMI-21-2-0178.