Agrobacterium-опосередкована трансформація тютюну (Nicotiana tabacum L.) геном лактоферину людини та аналіз трансгенних ліній
Анотація
Мета. Отримання ліній тютюну (Nicotiana tabacum L.), стабільно трансформованих геном лактоферину людини (hLf), та їх аналіз. Методи. Agrobacterium-опосередковану трансформацію тютюну проводили за використання плазміди pBin35LF, яка містила ген лактоферину під контролем 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV 35S), а також селективний маркерний ген неоміцинфосфотрансферази II (nptII), який забезпечує стійкість до канаміцину. Селекцію трансгенних ліній проводили протягом 3 місяців на середовищі МС за наявночті 100 мг/л канаміцину. Інтеграцію гена лактоферину підтверджували за допомогою ПЛР із використанням праймерів, специфічних до гена hLf. Дослідження каріотипу трансгенних ліній проводили після фарбування клітин коренів 1 % розчином ацетоорсеїну. Результати. У результаті ПЛР-аналізу було виявлено 2 трансгенні лінії тютюну, в геномі яких було підтверджено інтеграцію гена hLf. Ефективність трансформації становила 6,4 %. Кількість хромосом у трансгенних та контрольних лініях становила 2n=48. Висновки. Отримані трансгенні лінії тютюну мають морфологію та набір хромосом, ідентичний до контрольних рослин, внаслідок чого їх можна розглядати як рослинні системи експресії рекомбінантного лактоферину людини.
Ключові слова: ген лактоферину людини hLf, Nicotiana tabacum L., Agrobacterium-опосередкована трансформація, ПЛР, каріотип, трансгенні рослини.
Посилання
Naglaa A., Channapatna P., McHughen A. Genome editing for crop improvement: challenges and opportunities. GM Crops Food. 2015. Vol. 6. P. 183–205. doi: 10.1080/21645698.2015.1129937.
Zeng-Yu W., Brummer C. Is genetic engineering ever going to take off in forage, turf and bioenergy crop breeding? An. Bot. 2012. Vol. 110. P. 1317–1325. doi: 10.1093/aob/mcs027.
Pimentel D., Hunter M., LaGro J., Efroymson R., Landers J., Mervis F., McCarthy C., Boyd A. Benefits and risks of genetic engineering in agriculture. BioSci. 1989. Vol. 39 (9). P. 606–614. doi: 10.2307/1311090.
Yemets A., Tanasienko I., Krasylenko Yu., Blume Ya. Plant-based biopharming of recombinant human lactoferrin. Cell Biol. Int. 2014. Vol. 38. P. 989–1002. doi: 10.1002/cbin.10304.
Lakshman D., Natarajan S., Mandal S., Mitra A. Lactoferrin derived resistance against plant pathogens in transgenic plants. J. Agric. Food Chem. 2013. Vol. 61 (48). P. 11730–11735. doi: 10.1021/jf400756t.
Conley A., Zhu H., Le L., Jevnika A., Lee B., Brandle J., Menassa R. Recombinant protein production in a variety of Nicotiana hosts: a comparative analysis. Plant Biotech. J. 2011. Vol. 9. P. 434–444. doi: 10.1111/j.1467-7652.2010.00563.x.
Buziashvili A., Cherednichenko L., Kropyvko S., Blume Y., Yemets A. Obtaining of transgenic potato plants expressing human lactoferrin gene and analysis of their resistance to phytopathogens. Cytol. Genet. 2020. Vol. 54 (3). P. 3–15. doi: 10.3103/S0095452720030020
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473–497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.
Rogers S., Bendich A. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Mol. Biol. 1985. Vol. 5. P. 69–76. doi: 10.1007/BF00020088.
Baskaran P., Soós V., Balázs E., Van Stadena J. Shoot apical meristem injection: A novel and efficient method to obtain transformed cucumber plants. South African J. Bot., 2016. Vol. 103. P. 210–215. doi:10.1016/j.sajb.2015.09.006.
Syakhril B. Aceto-orcein staining for counting somatic chromosomes in castor (Ricinus communis L.). Biosci. Res. 2019. Vol. 16 (2). P. 2336–2342.
Rosales-Campos A., Gutiérrez-Ortega A. Agrobacterium-mediated transformation of Nicotiana tabacum cv. Xanthi leaf explants. Bio-protocol. 2019. Bio101: e3150. doi: 10.21769/BioProtoc.3150.
Suleiman A. Transformation of Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens carrying salt and drought tolerance gene. Advances Environ. Biol. 2016. Vol. 10. P. 150–154. doi: 10.1016/j.sajb.2007.03.011
