Отримання рекомбінантного злитого білка rhIL7-BAPmut та його функціональна характеристика
Анотація
Мета. Метою роботи було отримання у функціонально активній формі рекомбінантного злитого білка на основі інтерлейкіну-7 людини (rhIL7) і бактерійної лужної фосфатази (BAPmut). Методи. ДНК послідовності, що кодують rhIL-7 і BAPmut, було субклоновано у плазмідний вектор pET24a(+), який містив послідовність 6His-tag для подальшого хроматографічного очищення цільового білка. Плазмідним вектором pET24-rhIL7-BAPmut трансформували клітин Escherichia coli штаму BL21(DE3). Синтез білка індукували внесенням ІПТГ і за протоколом аутоіндукції. Біфункціональну активність rhIL7-BAPmut після ренатурації плавним розведенням підтверджено імунохімічними методами шляхом зв’язування зі специфічними антитілами. Результати. Сконструйовано злитий білок rhIL7-BAPmut. Встановлено, що застосування протоколу аутоіндукції забезпечує значно вищий рівень синтезу білка в E. coli у порівнянні з індукцією ІПТГ. Відпрацьовано метод очищення і ренатурації rhIL7-BAPmut із бактерійних тілець включення in vitro. З’ясовано, що rhIL7-BAPmut після ренатурації має специфічну біологічну активність. Висновки. Отриманий білок rhIL7-BAPmut надалі може бути використаний для проведення скринінгу імунних комбінаторних бібліотек кДНК варіабельних генів імуноглобулінів, що є джерелом специфічних одноланцюгових антитіл, а також для якісного і кількісного аналізу рецепторів до IL-7.
Ключові слова: IL-7, BAPmut, бактерійні тільця включення, ренатурація.
Посилання
Takada K., Jameson S.C. Naive T cell homeostasis: from awareness of space to a sense of place. Nat. Rev. Immun. 2009. Vol. 9. P. 823–832. doi: 10.1038/nri2657.
Corfe S.A., Paige C.J. The many roles of IL-7 in B cell development; Mediator of survival, proliferation and differentiation. Seminars in Immunology. 2012. Vol. 24. P. 198–208. doi: 10.1016/j.smim.2012.02.001.
Slyvka A.V., Okunev O.V. Molecular mechanisms of versatile biological activity of interleukin-7. Biopolym. Cell. 2014. Vol. 30. P. 349–357. doi: 10.7124/bc.0008B1.
Palmer M.J., Mahajan V.S., Trajman L.C., Irvine D.J., Lauffenburger D.A., Chen J. Interleukin-7 Receptor Signaling Network: An Integrated Systems Perspective. Cellular & Molecular Immunology. 2008. Vol. 5. P. 79–89. doi: 10.1038/cmi.2008.10.
Lundström W., Fewke N.M., Mackall C.L. IL-7 in human health and disease. Seminars in immunology. 2012. Vol. 24. P. 218–224. doi: 10.1016/j.smim.2012.02.005.
Hartling H.J., Ryder L.P., Ullum H., Ødum N., Nielsen S.D. Gene variation in IL-7 receptor (IL-7R)α affects IL-7R response in CD4+ T cells in HIV-infected individuals. Sci. reports. 2017. Vol. 7. P. 42036 (1–8). doi: 10.1038/srep42036.
Haas J., Korporal M., Schwarz A., Balint B., Wildemann B. The interleukin-7 receptor α chain contributes to altered homeo-stasis of regulatory T cells in multiple sclerosis. Eur. J. Immunol. 2011. Vol. 41. P. 845–853. doi: 10.1002/eji.201041139.
Taheri M., Sayad A. Investigating the exon 6 sequence changes of interleukin 7 receptor A (IL7RA) gene in patients with re-lapsing-remitting multiple sclerosis. Hum. Antibodies. 2018. Vol. 26. P. 43–48. doi: 10.3233/HAB-170320.
Lundström W., Hermanrud C., Sjöstrand M., Brauner S., WahrenHerlenius M., Olsson T., Karrenbauer V., Hillert J., Fogdell-Hahn A. Interferon beta treatment of multiple sclerosis increases serum interleukin-7. Multiple Sclerosis Journal. 2014. Vol. 20. P. 1727–1736. doi: 10.1177/1352458514532700.
Gorbatiuk O.B., Okunev O.V., Nikolaev Yu.S., Svyatenko O.V., Kordium V.A. Construction, expression, functional сharacterization and practical application of fusion protein SPA-ВAPmut. Biopolym. Cell. 2013. Vol. 29. P. 49–54. doi: 10.7124/bc.000805.
Muller B.H., Lamoure C., Le Du M.H., Cattolico L., Lajeunesse E., Lemaitre F., Pearson A., Ducancel F., Menez A., Boulain J.C. Improving Escherichia coli alkaline phosphatase efficacy by additional mutations inside and outside the catalytic pocket. Chembiochem. 2001. Vol. 2. P. 517–523. doi: 10.1002/1439-7633(20010803)2:7/8<517::aid-cbic517>3.0.co;2-h.
Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory Manual. Second edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1659 p.
Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 41. P. 207–234. doi: 10.1016/j.pep.2005.01.016.
Gorbatuk O.B., Nikolayev U.S., Irodov D.M., Dubey I.Ya., Gilchuk P.V. Refolding of ScFv-CBD fusion protein from Es-cherichia coli inclusion bodies. Biopolym. Cell. 2008. Vol. 24, № 1. Р. 51–59. [in Ukrainian]
