Створення генетичних конструкцій за допомогою методу клонування Golden Gate

  • О. І. Варченко
  • Б. М. Красюк
  • О. О. Федчунов
  • О. В. Зіміна
  • М. Ф. Парій
  • Ю. В. Симоненко
DOI: https://doi.org/10.7124/FEEO.v25.1163

Анотація

Мета. Створення генетичних конструкцій для вивчення впливу різних регуляторних елементів, а саме промоторів, на експресію репортерного білка GFP. Методи. Для створення генетичних конструцій використовували метод молекулярного клонування Golden Gate, що дозволяє за допомогою рестриктаз IIS типу та Т4 ДНК-лігази швидко створювати генетичні вектори. Результати. Для досліджень було обрано 6 різних промоторів, а саме 35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти CaMV (Cauliflower Mosaic Virus), подвійний 35S промотор CaMV, промотори генів RbcS2B та RbcS1B, що кодують малу субодиницю рибулозобісфосфаткарбоксилази (RuBisCo), виділених із Різушки Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.), та промотори генів, що кодують хлорофіл a-b зв’язуючі білки (LHB1B1 та LHB1B2), також виділених з A. thaliana. Усі транскрипційні одиниці додатково містили такі елементи: 5'-послідовність Ω, що не транслюється (UTR), з віруса тютюнової мозаїки TMV (Tobacco Mosaic Virus); кодуючу послідовність гена gfp (Green Fluorescent Protein), виділеного з A. victoria, та 35S термінатор CaMV разом із сигналом поліаденюлювання та 3'-послідовністю, що не транслюється. У результаті роботи створено шість генетичних конструкцій із різними регуляторними елементами, а саме промоторами. Висновки. Створені генетичні конструкції можуть бути використані для вивчення впливу різних регуляторних елементів, а саме промоторів, на експресію репортерного білка GFP за транзієнтної або стабільної генетичної трансформації рослин.

Ключові слова: клонування, генетичні конструкції, промотори, зелений флуоресцентний білок (Green Fluorescent Protein, GFP).

Посилання

Redberry G. Gene silencing: new research. New York: Nova Science Publishers. 2006. 212 p.

Kahl L.J., Endy D. A survey of enabling technologies in synthetic biology. J. Biol. Eng. 2013. Vol. 7. P. 13.

Anderson J.C., Dueber J.E., Leguia M., Wu G.C., Goler J.A., Arkin A.P., Keasling J.D. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J. Biol. Eng. 2010. Vol. 4. P. 1.

Shetty R.P., Endy D., Knight T.F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2008. Vol. 2. P. 5.

Shetty R., Lizarazo M., Rettberg R., Knight T.F. Assembly of BioBrick standard biological parts using three antibiotic assembly. Methods Enzymol. 2011. Vol. 498. P. 311−326.

Sleight S.C., Bartley B.A., Lieviant J.A., Sauro H.M. In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering. Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38. P. 2624−2636.

Xu P., Vansiri A., Bhan N., Koffas M.A.G. ePathBrick: a synthetic biology platform for engineering metabolic pathways in E. coli. ACS Synth. Biol. 2012. Vol. 1. P. 256−266.

Engler C., Kandzia R., Marillonnet S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 2008. Vol. 3. P. 3647.

Ellis T., Adie T., Baldwin G.S. DNA assembly for synthetic biology: from parts to pathways and beyond. Integr. Biol. (Camb). 2011. Vol. 3. P. 109−118.

Weber E., Engler C., Gruetzner R., Werner S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 2011. Vol. 6. P. 16765.

Sarrion-Perdigones A., Falconi E.E., Zandalinas S.I., Juárez P., Fernándezdel-Carmen A., Granell A., Orzaez D. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 2011. Vol. 6. P. 21622.

Werner S., Engler C., Weber E., Gruetzner R., Marillonnet S. Fast track assembly of multigene constructs using Golden Gate cloning and the MoClo system. Bioeng. Bugs. 2012. Vol. 3. P. 38−43.

Engler C., Gruetzner R., Kandzia R., Marillonnet S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PloS One. 2009. Vol. 4, № 5. P. 5553.

Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression. Science. 1994. Vol. 263. P. 802–805.

Chiu W-L., Niwa Y., Zeng W., Hirano T., Kobayashi H., Sheen J., Engineered GFP as a vital reporter in plants. Curr. Biol. 1996. Vol. 6. P. 325–330.

Ow D., Jacobs J., Howell S. Functional regions of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter determined by use of the firefly luciferase gene as a reporter of promoter activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987. Vol. 84. P. 4870–4874.

Guilley H., Dudley R., Jonard G., Balàzs E., Richards, K., Transcription of Cauliflower mosaic virus DNA: detection of pro-moter sequences, and characterization of transcripts. Cell. 1982. Vol. 30. P. 763–773.

Kay R., Chan A., Daly M., McPherson J. Duplication of CaMV 35S Promoter Sequences Creates a Strong Enhancer for Plant Genes. Science. 1987. Vol. 236. P. 1299–1302.

Dedonder A., Rethy R., Fredericq H., Van Montagu M., Krebbers E. Arabidopsis rbcS genes are differentially regulated by light. Plant Physiol. 1993. Vol. 101. P. 801–808.

McGrath J., Terzaghi W., Sridhar P., Cashmore A., Pichersky E. Sequence of the fourth and fifth Photosystem II type I chloro-phyll a/b-binding protein genes of Arabidopsis thaliana and evidence for the presence of a full complement of the extended CAB gene family. Plant Mol. Biol. 1992. Vol. 19. P. 725–733.

Gallie D.R., Sleat D.E., Watts J.W., Turner P.C., Wilson T.M. The 5’-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo. Nucleic Acids Res. 1987. Vol. 15. P. 3257–3273.

Making Calcium Competent Cells. URL: http://mcb.berkeley.edu/labs/krantz/protocols/calcium_comp_cells.pdf (Last ac-cessed: 5.04.2019).

Froger A., Hall J.E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experi-ments: JoVE. 2007. Vol. 6.

Lerner C.G., Inouye M. Low copy number plasmids for regulated low-level expression of cloned genes in Escherichia coli with blue/white insert screening capability. Nucleic acids research. 1990. Vol. 18, № 15. P. 4631.

Lezin G., Kosaka Y., Yost H.J., Kuehn M.R., Brunelli L. A one-step miniprep for the isolation of plasmid DNA and lambda phage particles. PLoS One. 2011. Vol. 6, № 8. P. 23457.

URL: http://sites.bio.indiana.edu/~pikaardlab/PDFs%20and%20protocol%20files%20/agrotransform.html (Last accessed: 1.04.2019).

Bendandi M., Marillonnet S., Kandzia R., Thieme F., Nickstadt A., Herz S., Frode R., Inoges S., Lopez-Diaz de Cerio A., Soria, E., Villanueva H., Vancanneyt G., McCormick A., Tuse D., Lenz J., Butler-Ransohoff J.E., Klimyuk V., Gleba Y. Rapid, high-yield production in plants of individualized idiotype vaccines for non-Hodgkin’s lymphoma. Ann. Oncol. 2010. Vol. 21. P. 2420–2427.

Tuse, D. et al. Clinical Safety and Immunogenicity of Tumor-Targeted, Plant-Made Id-KLH Conjugate Vaccines for Follicular Lymphoma. BioMed. Res. Int. 2015. P. 648143.

Werner S., Breus O., Symonenko Y., Marillonnet S., Gleba Y. High-level recombinant protein expression in transgenic plants by using a double-inducible viral vector. Proc Natl Acad Sci USA. 2011. Vol. 108, № 34. P. 14061–14066.

Hahn S., Giritch A., Bartels D., Bortesi L., Gleba Y. A novel and fully scalable Agrobacterium spray-based process for manu-facturing cellulases and other costsensitive proteins in plants. Plant Biotechnol J. 2015. Vol. 13, № 5. P. 708–716.

Schulz S., Stephan A., Hahn S., Bortesi L., Jarczowski F., Bettmann U. et al. Broad and efficient control of major foodborne pathogenic strains of Escherichia coli by mixtures of plant-produced colicins. Proc Natl Acad Sci USA. 2015. Vol. 112. P. E5454–5460.