Генетична трансформація Nicotiana tabacum дріжджовими генами біосинтезу трегалози TPS1 та TPS2

  • А. Ю. Кваско Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Україна, 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а
  • С. В. Ісаєнков Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Україна, 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а
  • О. Є. Краснопьорова Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Україна, 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а
  • К. В. Дмитрук Інститут біології клітини НАН України Україна, 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16
  • А. І. Ємець Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, Україна, 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а
DOI: https://doi.org/10.7124/visnyk.utgis.17.2.1215

Анотація

Мета. Метою роботи було створення генетичних векторних конструкцій з дріжджовими генами біосинтезу трегалози TPS1 та TPS2 та їх використання у Agrobacterium опосередкованій трансформації тютюну (N. tabacum). Методи. Для трансформації рослин було використано штам Agrobacterium tumefaciens GV3101, який містив конструкції pGWВ2-TPS1 та pGWВ2-TPS2 з цільовими генами TPS1 та TPS2, відповідно, що знаходились під контролем 35S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти, а також селективним маркерним геном гігроміцин-фосфотрансферази (hpt). Як експланти для трансформації використовували листові диски N. tabacum. Селекцію трансгенних ліній здійснювали на поживному середовищі з додаванням гігроміцину. Результати. Створено векторні конструкції pGWВ2-TPS1 та pGWВ2-TPS2, апробовані шляхом генетичної трансформації N. tabacum як модельного об’єкту. За допомогою методу Agrobacterium-опосередкованої трансформації перенесено гени TPS1 і TPS2 та відібрано лінії N. tabacum на середовищі, що містило селективну концентрацію (25 мг/л) гігроміцину. Трансгенну природу відібраних ліній підтверджено за допомогою методу ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) з використанням специфічних праймерів до генів TPS1 і TPS2. Висновки. Отримано трансгенні лінії рослин тютюну з генами біосинтезу трегалози TPS1 та TPS2. Встановлено чутливість відібраних трансгенних ліній до різних цукрів у живильних середовищах для індукції пагоноутворення та укорінення рослин N. tabacum. Підібрано умови для підвищення частоти трансформації та для укорінення трансгенних ліній, що містять у своєму геномі цільові гени TPS1 та TPS2.
Ключові слова: трегалоза, дріжджові гени TPS1, TPS2, генетична трансформація, Nicotiana tabacum.

Посилання

Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J. A., Struhl K. Current Protocol in Molecular Biology. New York: John Wiley, 1987. P. 431–433.

Curtis I. S., Davey M. R., Power J. B. Leaf Disk Transformation. Agrobacterium Protocols. 1995. Vol. 5. P. 59–70. doi: 10.1385/0-89603-302-3:59.

Divate N. R., Chen G.-H., Divate R. D., Ou B. R., Chung Y. C. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for improvement in stresses tolerance. Bioengin. 2017. Vol. 5. P. 524–535. doi: 10.1080/21655979.2016.1257449.

Fingueroa C. M., Feil R., Ishihara H., Watanabe M., Kolling K., Krause U., Hohne M., Encke B., Plaxton W. C., Zeeman S. C., Li Z., Schulze W. X., Hoefgen R., Stitt M., Lunn J. E. Trehalose-6- phosphate coordinates organic and amino-acid metabolism with carbon availability. Plant J. 2016. Vol. 85. P. 410–423. doi: 10.1104/pp.16.00417.

Fleuler F., Stettler T., Meyerhofer M., Leder L., Mayr I. M. Development of a novel Gateway-based vector system for efficient, multiparallel protein expression in Escherichia coli. Protein Expr.Purif. 2008. Vol. 59. P. 232–241. doi: 10.1016/j.pep.2008. 02.003.

Goddijn J. M., Verwoerd Th. C., Voogd E., Krutwagen R. W. H. H., de Graaf P. T. H., Poeis J., van Dun K., Ponstein A. S., Damm B., Pen J. Inhibition of trehalase activity enhances trehalose accumulation in transgenic plants. Plant Physiol. 1997. Vol. 113. P. 181-190. doi: 10.1104/pp.113.1.181.

Gomes D. L., Baud S.,Gilday A., Li Y., Graham A. Delayed embryo development in the Arabidopsis trehalose-6-phoshate synthase 1 mutant is associated with altered cell wall structure, decreased cell division and starch accumulation. Plant J. 2006. Vol. 46. P. 69–84. doi:10.1111/j.1365-313X.2006.02 662.x.

Iordachescu M., Imai R. Trehalose biosynthesis in response to abiotic stresses. J. Integr. Plant Biol. 2008. Vol. 50. P. 1223–1229. doi: 10.1111/j.1744- 7909.2008.00736.x.

Jung I.-C., Oh S.-J., Seo J.-S., Choi W.-B., Song S. J., Kim Ch. H., Kim Y. Sh., Seo H.-S., Choi Y. D., Nahm B. H., Kim J.-K. Expression of a bifunctional fusion of the Escherichia coli genes for trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6- phosphate phosphatase in transgenic rice plants increases trehalose accumulation and abiotic stress tolerance without stunting growth. Plant Physiol. 2003. Vol. 131. P. 516–524. doi:10.1073/pnas.1322 135111.

Karim S., Aronsson H., Ericson H., Pirhonen M., Leyman B., Welin B., Mantyla E., Palva E. T., Dijck P. V., Holmstrom K. O. Improved drought tolerance without undesired side effect in transgenic plants producing trehalose. Plant Mol. Biol. 2007. Vol. 64. P. 371–386. doi:10.1007/s11103-007-9159-6.

Karimi M., Inze D., Depicker A. GATEАWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends. Plant Sci. 2002. Vol. 7. P. 193–195. doi: 10.1038/nature05286.

Kwon H. B., Yeo E. T., Hahn S. E., Bae S. C., Kim D. Y., Byun M. O. Cloning and characterization of genes encoding trehalose-6-phosphate synthase (TPS1) and trehalose-6-phosphate phosphatase (TPS2) from Zygosaccharomyces rouxii. Yeast Research. 2003. Vol. 3. P. 433–440. doi: 10.1016/ S1567-1356(03)00035-7.

Lunn J. E., Delorge I., Figueroa C. M., Dijck P. V., Stitt M. Trehalose metabolism in plants. Plant J. 2014. P. 544–567. doi: 10.1111/tpj.12509.

Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473–497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.

O’Hara L. E., Paul M. J., Wingler A. How do sugars regulate plant growth and development? New insight into the role of trehalose-6-phosphate. Mol. r Plant. 2013. Vol. 8. P. 261–274. doi: 10.1093/mp/sss120.

Paul M. J., Primavesi L. F., Jhurreea D., Zhang Y. Trehalose metabolism and signaling Annual Rev. Plant Biol. 2008. Vol. 59. P. 417–441. doi: 10.1146/annurev.arplant.59.032607.092945.

Petitijean M., Teste M. A., Leger-Silvestre I., Francois J. M., Parrou J.-L. A new function for the yeast Trehalose-6P Synthase (Tps1) protein, as key pro-survival factor during growth, chronological ageing and apoptotic stress. Mechanisms Ageing Dev. 2016. doi: 10.1016/j.mad.2016.07.011.

Pilon-Smits E. A., Terry N., Sears T. Trehalose-producing transgenic tobacco plants show improved growth performance under drought stress. Plant Physiol.1998. Vol. 152. No. 4/5. P. 525–532.

Romero C., Belles J. B., Vaya J. L., Serrano R., Culianez-Macia A. Expression of the yeast trehalose- 6-phosphate synthase gene in transgenic tobacco plants: pleiotropic phenotypes include drought tolerance. Planta. 1997. Vol. 201. P. 293–297.

Rosales-Campos A. L., Gutierrez-Ortega A. Agrobacterium-mediated transformation of Nicotiana tabacum cv. Xanthi leaf explants. Bio-101. 2019. E3150. doi: 10.21769/BioProtoc.3150.

Schluepmann H., Pellne T., van Dijken A., Smeekers S., Paul M. Trehalose 6-phosphate is indispensable for carbohydrate utilization and growth in Arabidopsis thaliana. Proc. Nat. Acad. Sci (USA). 2003. Vol. 100. P. 6849–6854. doi: 10.1073/pnas.1132018100.

Seo H. S., Koo Y. J., Lim J. Y., Song J. T., Kim C. H., Kim J.-K., Lee J. S., Choi Y. D. Characterization of a bifunctional fusion enzyme between trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6-phosphatase of Escherichia coli. Appl. Environ Microbiol. 2000. Vol. 66. P. 2484–2490. doi: 10.1128/aem.66.6.2484-2490.2000.

Tuncer T. Transformation of tobacco (Nicotiana tabacum) with antimicrobial pflp gene and analysis of transgenic plants. In: Partial Fulfillment of the Requirements the Degree of Masters of Science in Biotechnology. 2006. P. 110.

Wang Y. J., Hao Y. J., Zhang Z. G., Chen T., Zhang J. S., Chen S. Y. Isolation of trehalose-6- phosphate phosphatase gene from tobacco and its functional analysis in yeast cells. J. Plant Physiol. 2004. Vol. 162. P. 215–223. doi: 10.1016/j.jplph. 2004.06.014.

Yatsyshyn V. Yu., Kvasko A. Yu., Yemets A. I. Genetic approaches in research on the role of trehalose in plants. Cytol Genet. 2017. Vol. 51, № 5. P. 62–78. doi: 10.3103/S0095452717050127.