Аналіз ефективності роботи системи сайт-специфічної рекомбінації Cre/LoxP впродовж декількох поколінь трансформантів Arabidopsis thaliana
Анотація
Мета. Проаналізувати ефективність роботи сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP протягом декількох поколінь трансформантів Arabidopsis thaliana. Методи. Досліджували приріст трансформантів Arabidopsis thaliana вільних від селективних маркерних генів впродовж декількох поколінь. Генетичну трансформацію рослин здійснювали згідно нового підходу до використання сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP під контролем 35S промотору. З цією метою були розроблені два варіанти ДНК-конструкції, що містили маркерний ген gus та ген рекомбінази cre, які обмежувались сайтами ексцизії loxP. Ген стійкості до гігроміцину hptII в обох конструкціях виносився за межі сайтів loxP і в разі здійснення події ексцизії залишався в геномі рослин. Селекцію трансформантів проводили на середовищі Мурасіге та Скуга із додаванням гігроміцину (100 мг/л). Подію рекомбіназної ексцизії маркерних генів у геномі визначали за допомогою гістохімічного аналізу та молекулярно-генетичного аналізу впродовж трьох поколінь трансформантів. Результати. Встановлено, що кількість трансформантів, які не містять маркерних генів, збільшується з кожним наступним поколінням незалежно від варіанта трансформуючої конструкції. Під час проведення молекулярно-генетичного аналізу було виявлено зведення кількості інтегрованої Т-ДНК на геном до мінімуму, що вказує на здатність сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP контролювати кількість подій інтеграції у геномі рослини. Висновки. Запропонований підхід є досить простим у використанні та є гарною можливістю отримання трансформованих рослин, вільних від маркерних послідовностей в геномі.
Ключові слова: селективні маркерні гени, видалення маркерних послідовностей, сайт-специфічна рекомбіназа.
Посилання
Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E., Endo S., Yamada K., Komamine A. Systems for the removal of a selection marker and their combination with a positive marker. Plant Cell Rep. 2001. Vol. 20. P. 383–392. doi: 10.1007/s002990100344
Cotsaftis O., Sallaud C., Breitler J.C., Meynard D., Greco R. et al. Transposon-mediated generation of T-DNA- and marker-free rice plants expressing a Bt endotoxin gene. Mol. Breed. 2002. Vol. 10. P. 165–180. doi: 10.1023/A:1020380305904
Daley M., Knauf V., Summerfelt K.R., Turner J.C. Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants. Plant Cell Rep. 1998. Vol. 17. P. 489–496. doi: 10.1007/s002990050430
Zubko E., Scutt C., Meyer P. Intrachromosomal recombination between attP regions as a tool to remove selectable marker genes from tobacco transgenes. Nat. Biotechnol. 2000. Vol. 18. P. 442–445. doi: 10.1038/74515
Hoa T.T.C., Bong B.B., Huq E., Hodges T.K. Cre/lox site-specific recombination controls the excision of a transgene from the rice genome. Theor. Appl. Genet. 2002. Vol. 104. P. 518–525. doi: 10.1007/s001220100748
Lloyd A.M., Davis R.W. Functional expression of the yeast FLP/FRT site-specific recombination system in Nicotiana tabacum. Mol. Gen. Genet. 1994. Vol. 242. P. 653–657. doi: 10.1007/BF00283419
Endo S., Sujita K., Sakai M., Tanaka H., Ebinuma H. Single step transformation for generating marker-free transgenic rice using the ipt-type MAT vector system. Plant J. 2002. Vol. 30. P. 115–122. doi: 10.1046/j.1365-313X.2002.01272.x
Maeser S., Kahmann R. The Gin recombinase of phage Mu can catalyse site-specific recombination in plant protoplasts. Mol. Gen. Genet. 1991. Vol. 230. P. 170–176. doi: 10.1007/BF00290665
Grindley N.D.F., Whiteson K.L., Rice P.A. Mechanisms of site-specific recombination. Annu. Rev. Biochem. 2006. Vol. 75. P. 567–605. doi: 10.1146/annurev.biochem.73.011303.073908
Zuo J., Niu Q.W., Moller S.G., Chua N.H. Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. Nat. Biotechnol. 2001. Vol. 19. P. 157–161.
Hoff T., Schnorr K.M., Mundy J. A recombinase-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. Plant Mol. Biol. 2001. Vol. 45. P. 41–49. doi: 10.1023/A:1006402308365
Kim H.-B., Cho J.-I., Ryoo N., et al. Development of a simple and efficient system for excision selectable markers in Arabidopsis using a minimal promoter::Cre fusion construct. Mol. Cells. 2012. Vol. 33(1). P. 61–69. doi: 10.1007/s10059-012-2212-6
Секан А.С., Ісаєнков С.В. Створення конструкцій з сайт-специфічною рекомбіназною системою Cre/loxP під контролем 35S промотору та їх використання для отримання трансформантів Arabidopsis thaliana, вільних від маркерних послідовностей. Наукові доп. НУБіП. 2014. № 5 (47). Режим доступу: http://nbuv.gov.ua/j-pdf/Nd_2014_5_3.pdf.
Секан А.С., Ісаєнков С.В. Ефективність трансформації Arabidopsis thaliana ДНК-конструкціями з рекомбіназною системою Cre/loxP. Biotech Acta. 2015. Т. 8, № 1. С. 50–55.
Секан А.С., Ісаєнков С.В., Блюм Я.Б. Використання сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP для отримання трансформантів Arabidopsis thaliana, вільних від маркерних послідовностей. Фактори експериментальної еволюції організмів. 2014. Т. 15. С. 128–133.
Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001. 2100 p.
Маниатис Т., Фрич Е.Ф., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 521 с.
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. Vol. 15(3). P. 473–497. doi: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x
Jefferson R.A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 1987. Vol. 5. P. 387–405. doi: 10.1007/BF02667740
Dellaporta S. L. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1983. Vol. 1. P. 19–21.
Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1990. 352 с.
Секан А.С., Ісаєнков С.В. Одноетапне отримання трансформантів Arabidopsis thaliana, вільних від маркерних послідовностей, за допомогою сайт-специфічної рекомбіназної системи Cre/loxP під контролем мінімального 35S промотору. Доп. НАН України. 2014. Т. 3. С. 158–163.
Chong-Perez B., Kosky R.G., Reyers M. Heat shock induced excision of selectable marker genes in transgenic banana by the Cre-lox site-specific recombination system. J. Biotechnol. 2012. Vol. 159(4). P. 265–273. doi: 10.1016/j.jbiotec.2011.07.031
