Стійкість до гліфосату і глюфозінату в поколіннях Т1–Т2 біотехнологічних рослин ріпаку (Brassica napus L.)

  • Л. О. Сахно Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03680, Київ, вул. Акад. Заболотного, 148
  • І. К. Комарницький Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03680, Київ, вул. Акад. Заболотного, 148
  • М. В. Кучук Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03680, Київ, вул. Акад. Заболотного, 148

Анотація

Мета. Отримати біотехнологічні рослини ріпаку з трансгенами epsps i bar, які введені в одному векторі, і дослідити успадкування чужорідних генів і стійкість до відповідних гербіцидів у поколіннях Т1–Т2. Методи. Генетична трансформація з використанням Agrobacterium tumefaciens, молекулярно-біологічні (ПЛР, ЗТ–ПЛР), генетичний (виявлення розщеплення за ознакою стійкості до фосфінотрицину в асептичних умовах), фізіологічний (виявлення стійкості до гербіцидів, визначення біомаси і сумарного розчинного білка (СРБ)). Результати. Отримано трансгенні рослини ріпаку з генами стійкості до гербіцидів на основі гліфосату (epsps) і глюфозінату (bar). Показано введення чужорідних генів у ядерну ДНК і їхню активність на рівні транскрипції. Підтверджено стійкість біотехнологічних рослин до дії гербіцидів при обробці у теплиці. Виявлено стабільне і зчеплене успадкування введених трансгенів. Показано, що трансгенні рослини, вирощені в умовах закритого грунту і не оброблені гербіцидом, не відрізняються  від вихідних нетрансформованих за біомасою і вмістом СРБ у листках. Виявлено, що обприскування гербіцидами не впливає на темпи росту біотехнологічних рослин, біомасу і СРБ. Висновки. Отримано біотехнологічні рослини ріпаку, які мають у ядерному геномі гени стійкості до гербіцидів на основі гліфосату (epsps) і глюфозінату (bar). Експресію трансгенів підтверджено у поколіннях Т1-Т2. Вона не впливає на накопичення біомаси і вміст СРБ у отриманих рослин в умовах закритого грунту.

Ключові слова: Brassica napus ріпак, epsps, bar, гліфосат, глюфозінат.

Посилання

Amrhein, N., B. Deus, P. Gehrke, H. C. Steinrücken. The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate, II: interference of glyphosate with chorismate formation in vivo and in vitro. Plant Physiol. 1980. V.66, N 5. – P.830–834.

James C. 2003. ISAAA Briefs: Preview, Global Status of Commercialized Transgenic Crops, In ISAAA Briefs 30, ISAAA, Ithaca, NY.

Pocket K No. 10: Herbicide Tolerance Technology: Glyphosate and Glufosinate. https://isaaa.org/resources/publications/pocketk/10/default.asp

Lea P.J., Joy K.W., Ramos J.L., Guerroro M.G. The action of 2-amino-4-(methylphosphiny)-butanoic acid (phosphinothricin) and its 2-oxoderivative on the metabolism of cyanobacteria and higher plants. Phytochem. 1984. V.23, N 1. P.1–6.

Kahrizi D., Salmanian A.H., Afshari A. et al. Simultaneous substitution of Gly96 to Ala and Ala183 to Thr in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene of E. coli (k12) and transformation of rapeseed (Brassica napus L.) in order to make tolerance to glyphosate. Plant Cell Rep. 2007. V.26, N 1. Р.95–104.

Chhapekar S., Raghavendrarao S., Pavan G. et al. Transgenic rice expressing a codon-modified synthetic CP4-EPSPS confers tolerance to broad-spectrum herbicide, glyphosat. Plant Cell Rep. 2015. V.34, N 5. P.721–731.

Nicolia A., Ferradini N., Molla G. et al. Expression of an evolved engineered variant of a bacterial glycine oxidase leads to glyphosate resistance in alfalfa J. Biotechnol. 2014. V.184. P.201–208.

Vencill W.K., Nichols R.L., Webster T.M., et al. Herbicide resistance: toward an understanding of resistance development and the impact of herbicide-resistant crops. Weed Science. 2012. Special Issue. P.2–30.

http://roundupreadycanola.com.au/wp-content/uploads/2014/03/What-is-Triazine-Tolerant-Roundup-Ready-canola1.pdf

Гочева Є.А., Сахно Л.О., Кучук М.В. Пат. 39205 UA 51 МПК А01Н1/00; А01Н4/00; А01Н5/00; С12N1/00; С12N5/00; С12N15/00. Спосіб отримання трансформованих рослин ріпаку методом агробактеріальної трансформації. Заявл. 03.10.2008. Публ. 10.02.2009, бюл. № 3.

Cheung W.Y., Hubert N., Landry B.S. A simple and rapid DNA microextraction method for plant, animal and insect suitable for RAPD and other PCR analyses. PCR Meths Applics. 1993. V.3, N 1. P. 69–70.

Logermann J., Schell J., Willmitzer L. Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal Biochem. 1987. V.163. P.16–20.

Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle to protein dye binding. Anal Biochem. 1976. V.72. P.248–254.

Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962. V.15, N 3. Р.473–497.

Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш.школа, 1990. 352 с.

Wang J. X., Zhao F. Y., Xu P. Use of aroA-M1 as a selectable marker for Brassica napus transformation. Crop Sci. 2006. V.46, N 2. Р.706–711.

Zang N., Zhai H., Gao S., et al. Efficient production of transgenic plants using the bar gene for herbicide resistance in sweet potato. Scientia Horticulturae. 2009. V.122, N 4. P.649–653.

Song G.-Q., Sink K.C., Callow P.W., et al. Evaluation of a herbicide-resistant trait conferred by the bar gene driven by four distinct promoters in transgenic blueberry plants. JASHS. 2008. V.133, N. 4. P.605–611.

Jardak-Jamoussi R., Bouamama B., Mliki A., et al. The use of phosphinothricin resistance as selectable marker for genetic transformation of grapevine. Vitis. 2008. V.47, N 1. P.35–37.

Lohar D.P., Schuller K., Buzas D. M. еt al. Transformation of Lotus japonicus using the herbicide resistance bar gene as a selectable marker. J. Exp. Bot. 2001. V. 52, N 361. P.1697–1702.

De Block M., Botterman J., Vandewiele M. et al. Engineering herbicide resistance in plants by expression of a detoxifying enzyme. EMBO J. 1987. V.6, N 9. P.2513–2518.

Spivak S. G. Berdichevets I. N., Yarmolinsky D. G., et al. Construction and characteristics of transgenic tobacco Nicotiana tabacum L. plants expressing CYP11A1 cDNA encoding cytochrome P450SCC. Rus. J. Genet. 2009. V. 45, N 9. P.1067–1073.

Vila-Aiub M.M., GohS.S., Gaines T.A., et al. No fitness cost of glyphosate resistance endowed by massive EPSPS gene amplification in Amaranthus palmeri. Planta. 2014. V.239, N 4. P.793–801.