Оптимізація умов ренатурації злитого білка rhIl7-BAPmut із тілець включення Escherichia coli та його практичне застосування

  • М. О. Усенко Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150; Державна установа "Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України", Україна, 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67
  • О. В. Окунєв Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150; Державна установа "Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України", Україна, 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67
  • К. І. Бенціонова Державна установа "Інститут охорони ґрунтів України", Україна, 03190, м. Київ, пров. Бабушкіна, 3
  • О. Б. Горбатюк Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150; Державна установа "Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України", Україна, 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67
  • Д. М. Іродов Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150; Державна установа "Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України", Україна, 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67
  • М. В. Ковальчук Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150; Державна установа "Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України", Україна, 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67
  • В. А. Кордюм Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150; Державна установа "Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України", Україна, 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67
DOI: https://doi.org/10.7124/visnyk.utgis.17.1.1199

Анотація

Мета. Метою нашої роботи була оптимізація методу ренатурації злитого білка rhIL7-BAPmut, створеного на основі рекомбінантного інтерлейкіну-7 людини (rhIL7) та бактерійної лужної фосфатази з підвищеними каталітичними властивостями (BAPmut), для його отримання у функціонально активній формі. Методи. Клітини E. coli BL21(DE3) трансформували плазмідним вектором pET24-IL7-BAPmut. Синтез білка індукували за протоколом аутоіндукції. Для ренатурації білка з бактерійних тілець включення in vitro застосовували іммобілізуючу металоафінну хроматографію (IMAX) та метод плавного розведення. Результати. Поєднання методів IMAX та плавного розведення в присутності аргініну, GSH/GSSG та іонів Mg2+ забезпечило отримання rhIL7-BAPmut в очищеній функціонально-активній формі. Біфункціональну активність rhIL7-BAPmut після ренатурації підтверджували імунохімічними методами шляхом зв’язування зі специфічними антитілами. Висновки. Було показано, що застосування rhIL7-BAPmut дозволяє значно скоротити час скринінгу імунної комбінаторної бібліотеки кДНК варіабельних генів імуноглобулінів і не потребує використання специфічних первинних і вторинних антитіл. Злитий білок rhIL7-BAPmut може також використовуватись для якісного та кількісного аналізу рецепторів IL-7.
Ключові слова: IL-7, BAPmut, бактерійні тільця включення, ренатурація.

Посилання

Aachmann F.L., Otzen D.E., Larsen K.L., Wimmer R. Structural background of cyclodextrin-protein interactions. Protein Engineering Design and Selection. 2003. Vol. 16. P. 905–912. doi: 10.1093/protein/gzg137

Ahmad Z.A., Yeap S.K., Ali A.M., Ho W.Y., Alitheen N.B.M., Hamid M. scFv antibody: Principles and clinical application. Clin. Dev. Immunol. 2012. P. 1-15. doi: 10.1155/2012/980250

Corfe S.A., Paige C.J. The many roles of IL-7 in B cell development; Mediator of survival, proliferation and differentiation. Seminars in Immunology. 2012. Vol. 24. P. 198–208. doi: 10.1016/j.smim.2012.02.001

Dirnbach E., Steel D.G., Gafni A. Mg2+ binding to alkaline phosphatase correlates with slow changes in protein lability. Biochemistry. 2001. Vol. 40. P. 11219-11226. doi: 10.1021/bi011399m

Ghosh N., Sarkar S.N., Roy K.B. Excess nucleoside triphosphates (or zinc) allow recovery of alkaline phosphatase activity following refolding under reducing conditions. Biochemistry. 1998. Vol. 37. Р. 15542-15547. doi: 10.1021/bi972833g

Gorbatiuk O.B., Okunev O.V., Nikolaev Yu.S., Svyatenko O.V., Kordium V.A. Construction, expression, functional сharacterization and practical application of fusion protein SPA-ВAPmut. Biopolym. Cell. 2013. Vol. 29. P. 49-54. doi: 10.7124/bc.000805

Gorbatuk O.B., Nikolayev U.S., Irodov D.M., Dubey I.Ya., Gilchuk P.V. Refolding of ScFv-CBD fusion protein from Escherichia coli inclusion bodies. Biopolymers and Cell. 2008. Vol. 24. P. 51-59. doi: 10.7124/bc.000790

Khodagholi F., Yazdanparast R. Cooperative effects of artificial chaperone and Mg2+ ions on alkaline phosphatase refolding. Biochemical Engineering Journal. 2007. Vol. 36. P. 123–130. doi: 10.1016/j.bej.2007.02.008

Khodagholi F., Yazdanparast R. Designing a highly efficient refolding system for alkaline phosphatase using combination of cyclodextrin and Mg2+ ion. Protein J. 2007. Vol. 27. P. 1–6. doi: 10.1007/s10930-006-9021-8

Lundström W., Fewke N.M., Mackall C.L. IL-7 in human health and disease. Seminars in immunology. 2012. Vol. 24. P.218-224. doi: 10.1016/j.smim.2012.02.005

Muller B.H., Lamoure C., Le Du M.H., Cattolico L., Lajeunesse E., Lemaitre F., Pearson A., Ducancel F., Menez A., Boulain J.C. Improving Escherichia coli alkaline phosphatase efficacy by additional mutations inside and outside the catalytic pocket. Chembiochem. 2001. Vol. 2. P. 517–523. doi: 10.1002/1439-7633(20010803)2:7/8<517::aid-cbic517>3.0.co;2-h

Singh A., Upadhyay V., Upadhyay A.K., Singh S.M., Singh A.K.P. et al. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microbial Cell Factories. 2015. Vol. 14. P. 1-10. doi: 10.1186/s12934-015-0222-8

Slyvka A.V., Okunev O.V. Molecular mechanisms of versatile biological activity of interleukin-7. Biopolym. Cell. 2014. Vol. 30. P. 349–357. doi: 10.7124/bc.0008B1

Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 41. P. 207-234. doi: 10.1016/j.pep.2005.01.016

Tsumoto K., Umetsu M., Kumagai I., Ejima D., Philo J. S., Arakawa T. Role of arginine in protein refolding, solubilization, and purification. Biotechnology Progress. 2004. Vol. 20. P. 1301–1308. doi: 10.1021/bp0498793

Usenko M.O., Okunev O.V., Bentsionova K.I., Gorbatiuk O.B., Irodov D.M., Kordium V.A. Obtaining of the recombinant rhIL7-BAPmut fusion protein and its functional characterization. Factors in Experimental Evolution of Organisms. 2019. Vol. 25. doi: 10.7124/FEEO.v25.1185

Weisser N.E., Hall J.C. Applications of single-chain variable fragment antibodies in therapeuticsand diagnostics. Biotechnology Advances. 2009. Vol.27. P. 502–520. doi: 10.1016/j.biotechadv.2009.04.004

Xu H., Zhang X., Zhang Z., Zhang Y., Cass A.E.G. Directed evolution of E. coli alkaline phosphatase towards higher catalytic activity. Biocatalysis and Biotransformation. 2003. Vol. 21. P. 41-47. doi: 10.1080/1024242031000087493

Yamaguchi H., Miyazaki M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 2014. Vol. 4. P. 235-251. doi:10.3390/biom4010235

Yazdanparast R, Khodagholi F. Kinetic aspects of alkaline phosphatase refolding in the presence of alpha-cyclodextrin. Arch. Biochem. Biophys. 2006. Vol. 446. P. 11 19. doi: 10.1016/j.abb.2005.11.018