Дослідження прояву трансгенів після Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta пшениці Triticum aestivum L.

  • Н. А. Жалій Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 148; Національний університет харчових технологій, Україна, 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68
  • М. О. Банникова Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 148
  • М. О. Плугатар ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна, 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64
  • Л. Г. Великожон Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 148
  • А. М. Тараненко Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 148
  • Б В. Моргун Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 148; ННЦ «Інститут біології та медицини», Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна, 01601, м. Київ, вул. Володимирська, 64
DOI: https://doi.org/10.7124/visnyk.utgis.16.2.1053

Анотація

Мета. Виявлення послідовностей цільових трансгенів nptII і bar у геномі ймовірних трансформантів пшениці м’якої озимої Triticum aestivum L. сортів Зимоярка та Подолянка, отриманих в результаті Agrobacterium-опосередкованої трансформації in planta, і з’ясування рівня їх експресії. Методи. Використовували метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) самостійно тау поєднанні із зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР), електрофорез ДНК у агарозному гелі. Толерантність до гербіциду оцінювали у фізіологічному тесті. Результати. За допомогою ПЛР-аналізу послідовність трансгена nptII виявлено у 30 зразках із 145 проаналізованих, частота трансформації склала 20,7 %. Послідовність гена bar спостерігалася у 85 дослідних рослинах, а частота трансформації склала 15,6 %. Виявлено мРНК обох трансгенів, що засвідчило їх транскрипційну активність та стабільну експресію. Висновки. Порівнюючи частоти трансформації обох трансгенів можна стверджувати про дещо вищу ефективність генетичної конструкції з nptII геном. Разом з тим, стабільна транскрипційна активність дає підстави констатувати успішне функціонування обох трансгенів в цілому, хоча і не у кожній конкретно взятій рослині (позиційний ефект). За результатами фізіологічного тесту 25 % рослин, що містять ген bar, виявили стійкість до гербіциду Баста®.
Ключові слова: генетично модифіковані організми, трансгенні рослини, біотехнологічні культури, пшениця м’яка озима, генетична інженерія.

Посилання

Method of creation of transgenic plants with high level of expression of transgenic proteins: pat. 2507736 Russian Federation. No2507736; app. 11.01.2011; pub. 27.02.2014, Bull. No 6.

Altpeter F., Vasil V., Srivastava V., Stöger E., Vasil I. K. Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. Plant Cell Reports. 1996. Vol. 16. P. 12-17. doi: 10.1007/BF01275440

Dai S. H., Zheng P., Marmey P., Zhang S. P., Tian W. Z., Chen S. Y., Beachy R. N., Fauquet C. Comparative analysis of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment. Mol Breed. 2001. Vol. 7. P. 25–33. doi: 10.1023/A:1009687511633

Ding L., Li S., Gao J., Wang Y., Yang G., He G. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation conditions in mature embryos of elite wheat. Mol Biol Rep. 2009. Vol. 36. P. 29–36. doi: 10.1007/s11033-007-9148-5

Hamada H., Linghu Q., Nagira Y., Miki R., Taoka N., Imai R. An in planta biolistic method for stable wheat transformation. Scientific Reports. 2017. Vol. 7:11443. doi: 10.1038/s41598-017-17188-2

Ishida Y., Tsunashima M., Hiei Y., Komari T. Wheat (Triticum aestivum L.) transformation using immature embryos. In Agrobacterium Protocols Vol. 1, Methods in Molecular Biology; Wang, K., Ed. Springer Science + Business Media: New York, NY, USA. 2014. Vol. 1223. P. 189–198. doi: 10.1007/978-1-4939-1695-5_15

IshidaY., Yukoh H., Toshihiko K. High efficiency wheat transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Advances in Wheat Genetics: From Genome to Field. 2015. Vol. 5. P. 167-175. doi: 10.1007/978-4-431-55675-6_18

Lazzeri P. A., Jones H. D. Transgenic wheat, barley and oats: production and characterization. Methods in Molecular Biology. 2009. Vol. 478. P. 3–22. doi: 10.1007/978-1-59745-379-0_1

Qin J B, Wang Y, Zhu C Q. Biolistic transformation of wheat using the HMW-GS 1Dx5 gene without selectable markers. Genetics and Molecular Research. 2014. Vol. 13. P. 4361–4371. doi: 10.4238/2014.June.10.3

Richardson T., Thistleton J., Higgins T., Howitt C., Ayliffe M. Efficient Agrobacterium transformation of elite wheat germplasm without selection. Plant Cell Tiss. Org. 2014. Vol. 119. P. 647–659. doi: 10.1007/s11240-014-0564-7

Sestili F., Janni M., Doherty A., Botticella E., D'Ovidio R., Masci S., Jones H. D., Lafiandra D. Increasing the amylose content of durum wheat through silencing of the SBEIIa genes. BMC Plant Biology. 2010. Vol. 10. P. 1–12. doi: 10.1186/1471-2229-10-144

Vasil V., Castillo A.M, Fromm M.E, Vasil I.K. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. Biotechnol. 1992. Vol. 10. P. 667–674. doi: 10.1038/nbt0692-667

Weeks J. T., Anderson O. D., Blechl A. E. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum L.). Plant Physiology. 1993. Vol. 102. P. 1077–1084. doi: 10.1104/pp.102.4.1077

Zhang Z., Liu X., Wang X., Zhou M., Zhou X., Ye X. et al. An R2R3 MYB transcription factor in wheat, TaPIMP1, mediates host resistance to Bipolaris sorokiniana and drought stresses through regulation of defense- and stress-related genes. New Phytol. 2012. Vol. 196. P. 1155–1170. doi: 10.1111/j.1469-8137.2012.04353.x

Zhou H., Arrowsmith J. W, Fromm M. E., Hironaka C. M., Taylor M. L., Rodriguez D., Pajeau M. E., Brown S. M., Santino C. G., Fry J. E. Glyphosate-tolerant CP4 and GOX genes as a selectable marker in wheat transformation. Plant Cell Reports. 1995. Vol. 15. P. 159–163. doi: 10.1007/BF00193711